48038 - پروژه آزمایشگاهی میکروبی..

شرح پروژه

نه نه فقط چند تا تست ازمایشگاهی هست،  توی پروپوزالی که خدمتتون فرستادم  ازمایشاتی که لازمه انجام بشه نوشته شده

آماده سازی باکتریها

دو گروه باکتری در این آزمایش مورد بررسی قرار میگیرد:

سویه استاندارد لاکتوباسیل اسیدوفیلوس PTCC 1643))

سویه استاندارد اشرشیا کلی (PTCC 1399)

ابتدا این سویهها تهیه شده و در محیط کشت به مدت دو هفته واکشت میشود تا خالص سازی گردد. سپس گروههای آزمایشی را به پنج گروه سه تایی (پنج تیمار در سه تکرار) تقسیم بندی میکنیم که در سه گیاه نیز انجام می شود:

گروه اول:  غلظت 20 میلی لیتر از عصاره (تکرار در سه پلیت)

گروه دوم: غلظت 25 میلی لیتر از عصاره (تکرار در سه پلیت)

گروه سوم: غلظت 30 میلی لیتر از عصاره (تکرار در سه پلیت)

گروه چهارم: غلظت 35 میلی لیتر از عصاره (تکرار در سه پلیت)

گروه شاهد 1: محیط کشت حاوی باکتریهای اشرشیاکلای در حضور دیسکهای استاندار جنتامایسین (در سه تکرار) برای آزمایش روی ایکولای، گروه شاهد2: محیط کشت حاوی باکتریهای لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در حضور دیسکهای استاندارد ونکومایسین (در سه تکرار) برای آزمایش روی لاکتوباسیلوس.

ابتدا 18 پلیت حاوی لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس را در محیط کشت بلاد آگار و 18 پلیت اشرشیاکلی مقاوم به آنتی بیوتیکهای رایج را در محیط کشت EMB آگار تهیه میکنیم که نوع کشت هر دو باکتری، کشت چمنی است. سپس سه عدد از هر کدام از پلیتهای حاوی باکتریها را گروه کنترل قرار میدهیم. در ادامه عصاره گیاه اول را با غلظتهای (20ml،25ml،30ml،35ml) در 100میلی لیتر آب حل میکنیم و جهت اثردهی عصارهها بر روی باکتریها، دیسکهای کاغذی از جنس کاغذ صافی، تهیه می کنیم. روش کار به این صورت است که توسط پانچ به تعداد زیاد یک کاغذ صافی را پانچ کرده و دیسکهای کاغذی از جنس کاغذ صافی تهیه شده توسط اتوکلاو استریل میشود و در ادامه پتریها با 100 میکرولیتر از باکتری مورد آزمایش تلقیح میشود؛ به این صورت که با استفاده از یک سوآپ استریل مقدار مشخصی از باکتری را برداشته و به صورت چمنی روی محیط، کشت میدهیم. وقتی باکتری روی پتریها کشت شد، برای اثر دادن عصارهها روی محیط کشت، در زیر هود، دوزهای مورد نظر از عصارههای آماده را با ذکر رقم روی دیسکهای کاغذی تهیه شده ریخته و اجازه میدهیم تا در زیر هود خشک شود. در ادامه، دیسکهاي کاغذ فیلتر که حاوی عصاره خشک شده بودند روی سطح محیط کشت پلیتهای حاوی لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس قرار داده شده و تحت شرایط مناسب در انکوباتور قرار داده میشود. عامل ضد میکروبي (عصارهها) در آگار پخش شده و مانع جوانه زني و رشد میکروارگانیسم مورد آزمایش میگردد. سپس از نظر قطر هاله بعد از 24، 48 و 72 ساعت مطابق استاندارد CLSI با استفاده از خط کش مورد بررسی و اندازهگیری قرار می گیرد و اثر ضد باکتریایی هر عصاره با مشاهده اندازه هاله عدم رشد مورد تفسیر قرار ميگیرد. این روش برای هر دو باکتری  و عصاره سه گیاه به صورت جداگانه انجام  می شود و موثرترین غلظت برای هر عصاره به دست میآید.

در مرحله بعد،  پنج گروه  آزمایشی با سه تکرار خواهیم داشت:

گروه آزمایشی اول: موثرترین غلظت  از تخم گشنیز و آویشن  (در سه تکرار)

گروه آزمایشی دوم : موثرترین غلظت تخم گشنیز و کاسنی (در سه تکرار)

گروه آزمایشی سوم: موثرترین غلظت آویشن و کاسنی (در سه تکرار)

گروه آزمایشی چهارم: موثرترین غلظت آویشن و کاسنی و تخم گشنیز (در سه تکرار)

گروه شاهد : کشت باکتری ها بدون حضور عصاره، افزودن آب مقطر به جای عصاره (در سه تکرار)

با اضافه کردن موثرترین غلظتهای هر گیاه دو به دو (تخم گشنیز و آویشن، تخم گشنیز و کاسنی، آویشن و کاسنی) و در آخر سه عصاره را با هم ترکیب میکنیم و به روش قبل به پلیتها اضافه میکنیم و میزان رشد و تکثیر باکتریهای درون پلیت با حضور دیسکهای حاوی ترکیب عصاره ها بررسی و مقایسه میکنیم تا بهترین ترکیب از همهی ترکیب ها مشخص شود .

آزمون دي متيل تيازول دي‌فنيل تترازوليوم برومايد یا MTT Assay

پس از تعیین بهترین دوز و بهترین ترکیب از مجموع عصاره ها، بررسی میزان سمیت این عصاره ها بر روی باکتری مفید لاکتوباسیل اسیدوفیلوس به روش MTT انجام خواهد شد.  ابتدا 104×1 باکتری  به همراه 100 میکرولیتر محیط کشت درون هر چاهک پليت كشت سلولي 96 چاهكي ريخته شده و سپس به مدت 24 ساعت در انكوباتور 37 درجه سانتي‌گراد قرار خواهد گرفت. سپس محیط کشت روی سلول‌ها تا حد امکان خارج کرده و 100 میکرولیتر از غلظتهای آماده شده از هر ماده به هر چاهك كشت افزوده شد و باکتریها براي مدت 24 ساعت ديگر در مجاورت ماده با غلظتهای مشخص قرار گرفتند. پس از آن محيط كشت خارج شده و 100 ميكروليتر MTT با غلظت 5/0 ميلي‌گرم بر ميلي‌ليتر در هر چاهك ریخته خواهد شد و به مدت 4 ساعت درانکوباتور قرار خواهدگرفت. پس از گذشت 4 ساعت محلول روي باکتریها خارج خواهد شد و ايزوپروپانول به آن‌ها اضافه گرديده تا بلورهاي بنفش رنگ ايجاد شده حل شوند. برای حل شدن بهتر رسوب MTT، پليت به مدت 15 دقيقه بر روی دستگاه شيكر قرار خواهدگرفت. سپس مقدار غلظت ماده حل شده در ايزوپروپانول با استفاده از دستگاه الايزاریدر (STAT FAX 2100, USA) در طول موج 545 نانومتر محاسبه خواهد شد. چاهك داراي باکتریهای بيشتر چگالي نوري (OD) بالاتري نسبت به چاهك با باکتری كمتر نشان مي‌دهد. بنابراين مي‌توان از رابطه زیر چاهك داراي مقدار باکتری بيشتر را مشخص كرد و با نمونه شاهد مقايسه نمود.

گزارش فقط در حد یک صفحه که مشخص بشه نتایج ازمایشات میکروبی که انجام شد چی هست

این پروپوزالی هست که داخل ان در قسمت روش اجرا ازمایشات میکروبی که باید انجام شود  کامل مشخص شده است

عصاره گیری ازگیاهان توسط، خود دانش اموزان انجام میشود و برای شما ارسال میشود

این پروژه شامل 3 فایل مهم است، لطفا قبل از ارسال پیشنهاد حتما نسبت به بررسی این فایل اقدام فرمایید.

مهارت ها و تخصص های مورد نیاز

درباره کارفرما

مهندس خوب

عضویت هشت سال پیش

15145 پروژه ثبت شده ،

23 پروژه در حال انجام ،

72 پروژه آماده دریافت پیشنهاد ،

نرخ پذیرش پیشنهاد 34%